一起仔猪伪狂犬病的实验室诊断

     王潇娣，朱玲
　　（四川农业大学动物医学院，四川雅安625014）
　　2011年8月，四川某猪场仔猪发生严重的腹泻症状，猪只病初体温升高、下痢、厌食，精神不振，呼吸困难，继而出现神经症状，共济失调，倒地四肢划动，最后衰竭死亡，死亡率高。解剖后可见肝脏有明显的灰白色坏死灶，脑部充血明显。通过流行病学调查和临床症状可初步判定为伪狂犬病，但是无法确诊。无菌采集病猪的脑组织进行实验室病原检测，以弄清发病原因，提供更加丰富、完善的研究材料和临床依据。
　　1材料与方法
　　1.1试验材料
　　1.1.1试验病料四川省某猪场发病仔猪的脑组织。1.1.2试验试剂  蛋白酶K、Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS、酚氯仿、无水乙醇、’rE、ddH20、2xGC buffer等。1.2试验方法
　　1.2.1引物设计根据猪伪狂犬病病毒的gE基因设计引物，引物序列如下。上游：5，-TGTGCTTCGA
　　GACCGCGTGCCA -3;下游：5,-TCGCCCACCGCCA
　　CAAAGAACA-37。预扩增目的条带大小为192 bp。1.2.2总DNA的提取
　　（1）取出米粒大的的脑组织放入匀浆器里进行匀浆。
　　（2）加500 vL消化Buffer （100 mg/L蛋白酶K、10 mmoVL Tris -HC1、15 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA.4 g/L SDS pH8.0），充分混匀，56℃水浴5h 以上。期间要翻动数次，使其充分混匀。
　　（3）加500 pdL 25:24的酚氯仿，混匀，13 000 rl mm离心10 min。
　　（4）取上清液，加等量的25:24的酚氯仿，混匀，13 000 r/min离心10 min。
　　（5）取上清液，加2倍体积的无水乙醇，轻摇混匀，直到出现絮状沉淀（未见沉淀提示DNA量不多）。
　　（6） 15 000 r/min离心3 mm。
　　（7）去上清液，加500 pjL 70%乙醇，充分混匀，15 000 r/min离心3 rmn。
　　（8）去上清液，晾干，加50 ~iL TE.完全溶解备用。1.2.3  PCR扩增  向PCR管里加入4.5 VL ddH20、12.5 ~_cL 2xGC buffer.4 pLL dNTP、1.5 VL Mg2+、0.5 VL上游引物（20 pmol/IJ[L）、0.5.pLL下游引物（20 pmol/puD、rap酶0.5 pdL、1斗L上步抽提的DNA，共25 }_cL。PCR反应程序：95℃变性5 min; 95℃35 s、50℃35 s.72℃30 s，进行35个循环；72℃延伸7 mm，4℃保存。
　　2结果
　　由图1可见，从发病仔猪脑组织病料中扩增出约200 bp的目的片段，与预扩增目的条带大小相吻合，且与阳性对照电泳条带大小一致。结合临床症状、剖检病变及PCR检测结果，可判定该猪群感染了伪狂犬病病毒野毒株。
　　3讨论
　　猪伪狂犬病在生产中较为常见，在临床上对仔猪的危害极大。猪自然感染本病的传播途径是鼻腔与口腔。可导致仔猪的严重腹泻和大量死亡。快速、准确地检测出猪只患病原因，对临床上预防和治疗具有积极的作用。
　　由于该病尚无特效药物治疗，所以预防该病的发生具有重要意义。目前免疫接种仍是预防和治疗该病的主要措施。缺失gE糖蛋白的基因工程苗已经成为世界首选使用的疫苗，能有效减轻猪感染后的临床症状，大幅降低发病。
　　与其他疾病的鉴别诊断。由于伪狂犬病与其他疾病的I临床症状有相似性，所以发病仔猪应注意与猪李氏杆菌病（败血型）等相鉴别。李氏杆菌病导致仔猪全身衰弱，病程1-3 d，病料涂片镜检可见“V”或“Y”型排列的革兰氏阳性小杆菌，用病料制成悬液接种家兔，不出现发痒撕咬局部的现象。